您好!欢迎登录北京酷来搏科技有限公司官方网站!

产品分类
当前位置:首页 > 新闻动态
引物不特异?不如试试利用NCBI设计。
日期:2019/10/8 访问:


    每天和分子生物学打交道的小伙伴,想必也经常被引物不特异搞的头晕脑胀,今天小编给大家推荐屡试不爽的引物设计方法,就是用NCBI在线设计,主要步骤如下:

1. 打开NCBI官网,在页面最下方找到“Primer-BLAST”,也可以直接点击(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)

QQ图片20191008103422.png


2. 将目的基因序列粘贴在页面的框框里;


QQ图片20191008103452.png


然后可以在“Primer Parameters”条目下将设置上下游起始位置,产物大小,退火温度等重要参数。


QQ图片20191008103525.png


为了更好的设计出特异性引物,还可在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”条目下将“Organism”后默认的人源种属更改为目的基因来源种属


QQ图片20191008103550.png


单击页面下方“Get Primers”,大功告成了


QQ图片20191008103633.png


网站一般会反聩10条引物供选择,可以根据下列条件筛选引物吗,其实也没太大必要,小编直接选用前两对,没问题。


1)连续相同的碱基≤3个;

2)GC所占比例在40%~60%之间;

3)引物自身或两条引物间不能有连续4个碱基互补;

4)引物3’端尽量不要以“A”结尾,但也应避免连续3个“G”或“C”。


初步验证引物特异性

(由于页面显示原因,在设计结果页面上给出的扩增结果有时并不是全部的可能扩增结果,因而需利用Primer-BLAST再次验证)

打开“Primer-BLAST”页面,在“Primer Parameters”条目下的两个框框里分别输入选定引物的正向序列和逆向序列,


QQ图片20191008103659.png


在下方修改引物所扩增基因的种属,“Get Primers”,等待数据库测试结果,根据结果判断是否有非特异性扩增,小编经验,只要上面选了相应的种属一般是没有问题的。