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MS培养基 不凝胶,或凝胶强度不稳定,Why?
日期:2020/7/17 访问:

常用的凝胶物质及其特点

植物组培培养基中常用的凝胶物质有琼脂(Agar,由麒麟菜、石花菜、江蓠等藻类提取)和植物凝胶(Phytagel,由假单胞菌发酵提取)。结冷胶(Gellan gum)也是由微生物发酵而来,类似植物凝胶。

琼脂凝固性、稳定性好,凝胶呈半透明胶体状,单价低,是较理想的培养基凝固剂。以Coolaber的琼脂(CA1331)为例,组培培养基的添加量为6-7g/L。植物凝胶相对用量少,单位重量凝胶强度大于琼脂,凝胶透明度优于琼脂,单价高,随储存时间加长会逐渐变酸(由7减至5),相对保质期短(密封2年)。Coolaber的植物凝胶(CP8581Z),组培培养基的添加量为3-4g/L。琼脂、植物凝胶对酸性条件敏感,pH值低于5难以成胶或凝胶偏软,植物凝胶成胶对钙镁二价阳离子浓度有要求,琼脂则没有。


 影响凝胶物质成胶的因素

1. 培养基的pH值偏低(且要考虑灭菌后培养基的pH值);

2. 灭菌条件;

3. 钙镁二价阳离子的浓度;

4. 灭菌后凝胶物质分布不均;

5. 配好的培养基未及时灭菌;

6. 凝胶物质的加入量;

7. 凝胶物质的保质期。


配制植物组培培养基的注意事项

1. 务必考虑琼脂,尤其是植物凝胶对培养基pH值的影响。先调整pH值后加入琼脂,培养基pH值会下降0.1左右。而植物凝胶对pH影响就要看其新鲜程度,刚打开包装的植物凝胶会把培养基的pH值拉高0.5,甚至更高;保存时间较久的植物凝胶可将培养基pH值拉低0.5,甚至更低,这个是由其特性决定的,其自身pH值范围在5-7之间,且随保存时间延长而降低,对培养基pH值影响无规律可循。对于无需更换盛具的培养基建议添加凝胶物质后再调整pH值。如需分装后灭菌,需加入琼脂的,可将培养基其它部分pH值调高0.1,分装后加入琼脂;但对于需添加植物凝胶的培养基,则建议预先测定调整pH值所需加入酸碱的量,根据该值先行调整培养基其它部分的pH值,分装后再行逐一加入植物凝胶。切记!


2. 高温高压灭菌会降低培养基的pH值。常规灭菌条件为115-121 ℃,15-30 min左右,Coolaber的实验结果(图1-3)说明,高温高压灭菌后培养基pH值会下降0.15-0.25,且灭菌温度越高,灭菌时间越长,pH下降值越大。培养基内的MS基盐含量越高,pH下降值越大。培养基内蔗糖含量对pH下降值影响不明显。一般推荐培养基pH值调至5.8-6.0,考虑高压灭菌对培养基pH值的影响,推荐灭菌条件115 ℃,20 min,或121 ℃,15 min。有条件的实验室也会采用过滤的方法除菌(凝胶物质后加入)。


3. 添加适当浓度的钙镁二价阳离子。Coolaber做过测试,不添加MS基盐的培养基(不含二价阳离子),植物凝胶不能成胶。因此减少MS等钙镁离子的基盐用量,务必要增加植物凝胶的用量,琼脂则不必考虑该问题。


4. 培养基灭菌后,冷却倒出前摇匀培养基。琼脂的密度大,培养基底层含量高,容易造成分布不均,使同一批灭菌培养基凝胶强度不一致。


5. 配好的培养基及时灭菌。Coolaber实验(图4)说明常温放置培养基3 h,pH值会下降0.35,时间越长下降越严重,24 h后会下降2.5左右,且MS基盐含量越低,缓冲能力越小,pH下降值越大。而4 ℃储存24 h,pH值下降幅度不大(<0.05)。组培培养基配好后,应马上调整pH值,第一时间高压灭菌,如不能马上灭菌,务必最快速度放入冰箱暂存。


6.  不同品牌,或同品牌不同批次的凝胶产品的凝胶强度是有差异的。因此对凝胶强度要求较高的实验在选择产品后,甚至同品牌不同批次产品都应该预实验测试凝胶强度,以确定最佳添加量(同批号可免)。对于较幼嫩组织材料分化生根用培养基应适当减少凝胶物质的用量,以降低凝胶强度。



7.  妥善保存凝胶产品。凝胶产品应常温、干燥保存,避免阳光直射,对于绝大多数试剂来讲,密封保存都是最优先的选择。琼脂可以储存2-3年,植物凝胶打开包装后应尽快用完,未使用完的产品务必密封储存(不要超过2年)。


影响凝胶强度的因素

1. 培养基的pH值。Coolaber实验结果表明,不同初始pH值(灭菌后pH值下降幅度相当,见图1)的培养基凝胶强度表现为:pH6.3>pH5.8>pH5.3。pH值低于5则难以成胶。


2. 凝胶物质加入量。相同条件下凝胶加入量越大,凝胶强度越大。


3. 钙镁二价阳离子浓度。相同植物凝胶添加量的培养基凝胶强度:MS>1/2MS>1/4MS。琼脂无明显表现。


4. 凝胶物质的存放时间。长时间开口存放的植物凝胶成胶后凝胶强度明显下降。琼脂相应降幅较低。


5. 凝胶产品自身的凝胶强度指标。各品牌的指标不一,且标注混乱。以琼脂为例,浓度1.5%,pH7条件下凝胶强度900-1000 g/cm2,或浓度2%,pH7为1200-1300 g/cm2。而植物凝胶浓度0.5%,pH7,含二价阳离子的化合物浓度0.08%条件下,凝胶强度为900-1000 g/cm2。能达到上述指标的产品就是非常优质的产品。


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结果与分析:不同初始pH值的MS培养基,不同灭菌条件下灭菌后pH值均明显下降,范围在0.1-0.25;灭菌温度越高或灭菌时间越长,pH下降值越大,但降幅不大(<0.05)。


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结果与分析:不同灭菌条件对培养基pH值下降的影响均与MS基盐的加入量相关,MS基盐越多,pH值下降越大;培养基pH值下降与MS含量相关性明显。


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结果与分析:不同灭菌条件对不同蔗糖加入量的MS培养基的pH下降值均有明显影响,但不同蔗糖加入量与培养基pH下降值没有明显相关。


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结果与分析:加入蔗糖后的,不同浓度MS基盐的培养基常温长时间放置pH值均下降明显,3 h下降0.35以上,放置时间越长,下降越严重;MS基盐加入量越低,缓冲能力减弱,培养基pH下降更为明显;未加入蔗糖的对照pH下降明显轻于加入蔗糖的培养基。4℃储存24 h,各种浓度MS培养基pH值降幅均不大(0.07-0.15)。


 
 
 
 

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