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产品分类

中文名:毕赤酵母转化试剂盒

英文名:Pichia pastoris positive clone assay kit

CAS:N/A

级别:N/A

分子量:N/A

分子式:N/A

纯度:N/A

储存条件:-20℃

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产品编号 规格 目录价(¥) 优惠价(¥) 数量 操作
SK2430-20T20T698698
产品简介

(一)酵母感受态细胞的制备:

1.活化菌种。-80℃保存的菌种在固体YPD培养基上划线,在30℃培养2-4天。

2.把酵母细胞接种到10 mL 液体YPD培养基中,30℃摇床过夜培养后将培养物按1%的接种量接种到100mL的YPD培养基中至OD值为0.6-1.0。

注:每10 mL菌液可用于一次转化。

3.3,000 rpm 离心3 min 收集菌体沉淀。

4.加入 5 mL 的B1溶液重悬菌体,3,000 rpm 离心3 min 收集菌体沉淀。

5.再加入 200 μL B1溶液重悬菌体,转移到无菌的 1.5 mL 离心管,可直接用于转化反应或冻存备用。 

6.  将感受态缓慢冷冻后置于-80℃冰箱保存。建议将感受态细胞放入程序降温盒,或者几层纸包好放入泡沫盒中,再放于-80℃冰箱过夜,后将感受态取出置于-80℃保存。保存半年基本不影响其转化效率。使用时,-80℃冰箱取出,直接用于转化,操作流程见(二)酵母转化。

注:缓慢冷冻会保证良好的转化效率。扩大酵母菌培养体积,相应增加冻存液的使用量,可以一次性制备多只酵母感受态细胞。

(二)酵母转化:

1.取0.1-5 μg的质粒DNA和10 μL 预变性Carrier DNA加入到未融化的感受态细胞上,置于30℃水浴,每隔15 s 颠倒混匀,直至感受态细胞开始融化。

2.从水浴锅中取出,颠倒混匀至感受态完全融化。

3.加入1.4 mL B2溶液颠倒混匀。30℃水浴60 min。

4.3,000 rpm 离心3 min 弃上清留菌体沉淀,加入1 mL B3溶液重悬菌体。

5.3,000 rpm 离心3 min 弃上清留菌体沉淀,加入100 μL B3溶液重悬菌体,将100 μL菌体全部涂布到相应的平板培养基,30℃恒温培养3-5天直至平板出现酵母克隆。

注意事项:

1. 初次使用Carrier DNA,请把装有Carrier DNA的管子在沸水中煮沸5 min,然后立即放在冰上,用后放在-20℃储存备用。下次使用时请在冰上解冻Carrier DNA。


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