您好!欢迎登录北京酷来搏科技有限公司官方网站!

产品分类

中文名:GST 标签蛋白纯化试剂盒II型(酶解)

英文名:GST-Tagged Protein purification Kit II

CAS:N/A

级别:N/A

分子量:N/A

分子式:N/A

纯度:N/A

储存条件:见包装

说明书下载点击下载 >>

产品编号 规格 目录价(¥) 优惠价(¥) 数量 操作
PTE009-2T2T998998
产品简介

产品内容:

1.png

注意:I型(PTE008)为超声裂解法,II(PTE009)型为酶解法。均适用于可溶性和包涵体中His标签蛋白的纯化。

产品说明:

1.重组蛋白 N 端的 GST 谷胱甘肽 S 转移酶(Glutathione S Transferase)能提高重组蛋白的水溶性,所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用 GST 标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合,并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立,是目前分离纯化 GST 标记蛋白质的重要方法。

2.只能在非变性条件下使用,只可用于纯化没形成包涵体的 GST 标记蛋白。

3.提供 5 mL 浓度为 50%的谷胱甘肽-Agarose 介质,可吸附 5-20 mg GST标记蛋白质。

4.本试剂盒可用于2次GST蛋白纯化(50mL 体积的细菌)。

操作步骤:

一:重组蛋白的表达和细菌收集

1. 37℃振荡培养 50 mL 含表达质粒的细菌到 OD600=0.6-0.8。 

2. 加 IPTG 到终浓度为 0.1 mM,30℃振荡培养 3 h 或 22℃振荡培养 8 h(或过夜)。 

3. 4℃ 5000 g 离心 10 min 收集 50 mL 表达菌液,弃上清。

4. 用30 mL 1×PBS 缓冲液重悬细菌沉淀,4℃ 5000 g 离心 10 min,弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。 

二: 谷胱甘肽层析柱的准备

1.将谷胱甘肽-琼脂糖介质充分混匀后,取2.5 mL加入到预放了一片筛板的层析柱中。

2.用 7.5 mL 预冷的洗涤液洗柱,共三次。

三: 裂解

(1)超声破碎细菌:在50mL 的细菌沉淀中加入 2.5 mL 冰浴的超声裂解缓冲液,再加入 125 uL PMSF(10 mg/mL)溶液,冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索,但裂解物必须不粘稠,否则会堵塞层析柱。

(2)酶法裂解细菌:加入 2.5 mL 冰浴的酶解液,再加入 125 uL PMSF(10 mg/mL)溶液,冰上放置 30 分钟。

四:纯化

1.将超声或酶法得到的细胞裂解物在 13,000 g 4℃离心 10 min去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱,所得上清即含可溶性 GST 标记蛋白。预留少量(如 100uL)作为裂解液留样,其余用于纯化。

2. 将上清液加入谷胱甘肽层析柱中,层析柱预先用盖子将底端的漏液口堵上。让细菌裂解液和介质在 4℃结合 1-12 h 后放开底端的盖子让重力使上柱液自然流出,收集并保存穿透液用于 SDS-PAGE 电泳。

注意:可将穿透液重新加入此层析柱中,以提高结合率。

3.用 10 mL 1×PBS 缓冲液洗柱,收集并保存穿透液(含杂蛋白)并预留100uL 作为穿透液留样,其余在确认实验成功后再丢弃。

4.用 0.2-0.5 mL GST 洗脱液洗柱,收集并保存穿透液,此穿透液即纯化的GST 标记蛋白样品。由于它可能含蛋白酶污染,所以纯化样品不能在 4℃长期放置,需留 100uL 左右用于后续浓度测定或/和 SDS-PAGE 电泳,其余放-80℃长期放置。

5.用裂解液留样(四-1)、穿透液留样(四-3)和纯化样品留样(四-4)进行蛋白定量或/和 SDS-PAGE 分析。

注意:本操作没有预先脱盐,故只能用 Bradford 法或 OD 检测法测定裂解液留样、穿透液留样和样品留 样的蛋白浓度。按 OD 检测法,1 OD280 约等于 0.5 mg/mL 蛋白。由于GST 的分子量为 26 KD,所以在 SDS-PAGE 胶上,GST 标记蛋白将比天然蛋白大 26 KD。

五:谷胱甘肽层析柱的恢复资料(自备试剂)

1. 用 3 倍介质体积的 6 M 盐酸胍处理柱子 10 分钟。介质为 2mL 则用 6mL,下同。

2. 用 3 倍介质体积的超纯水处理柱子 10 分钟。

3. 用 3 倍介质体积的缓冲液一(0.5 M NaCl,0.1 M TrisHCl,pH 8.5)处理柱子 10 分钟。

4. 用 3 倍介质体积的缓冲液二(0.5 M NaCl,0.1 M TrisHCl,pH 4.5)处理柱子 10 分钟。

5. 再重复 3-4 步两次。

6. 用 3 倍介质体积的超纯水处理柱子 3 次。

7. 若需要立即使用,则用 3 倍介质体积的 1×PBS 缓冲液处理柱子 2 次。堵上漏口,加 3 倍介质体积的 1×PBS 缓冲液洗涤后立即使用。

8. 若长时间不用,则上步的 1×PBS 改成 20%的乙醇,其余操作完全相同。


我的购物车 (0)

京ICP备13050818号-1